Обнаружение переносимого через воду и находящегося в воздухе формальдегида: от амперометрического хемосенсинга до визуального биосенсора на основе алкогольоксидазы

1. 2.1. Амперометрический анализатор для определения водного ТВС 2.1.1. Разработка и оптимизация электронного...
2. 2.1.2. Характеристика и оптимизация хемосенсирующих электродов
3. 2.1.3. Определение ФА в образцах сточных вод
4. 2.2. Полуколичественный визуальный биосенсор для бортовых ТВС

2.1. Амперометрический анализатор для определения водного ТВС

2.1.1. Разработка и оптимизация электронного модуля амперометрического хемосенсорного анализатора

Разработанный анализатор () состоит из амперометрического преобразователя и микрокомпьютера (МС) для управления процессом анализа, обработки и интерпретации информации. MC работает в интерактивном режиме, информация отображается на дисплее, а ключевой модуль используется для управления. Перемещение амперометрического преобразователя осуществляется шаговым двигателем.

( а ) Блок-схема МК; и ( b ) Фотография анализатора на основе хемосенсора.

Для оптимизации электронных схем микрокомпьютерной системы были решены следующие инженерные задачи: согласование электрических параметров преобразователя и МК, определение временных параметров этапов анализа, потенциала, усиления, условий обработки и представление аналитических результатов. Разработано и настроено программное обеспечение на основе микрокомпьютера для интерактивного управления и контроля этапов экспериментальных операций. Были выполнены следующие требования: обеспечение условий для анализа и формирование визуальных инструкций для устранения некорректных операций во время анализа. Было установлено, что микропроцессорная система на основе двух микрокомпьютеров (например, микроконтроллеров AT89C55WD) была разумной.

2.1.2. Характеристика и оптимизация хемосенсирующих электродов

Планарный углеродный электрод диаметром 4 мм DRP-150, плоский золотой электрод 4 мм DRP-C220AT («DropSens») и стержневой углеродный электрод 3,05 мм использовали для создания FA-селективных хемосенсоров. Все электроды были модифицированы платиновым черным в качестве катализатора в соответствии с [ 28 ].

Оптимизация рабочего потенциала для хемоселективного окисления ЖК также включала изучение селективности. На предварительных этапах исследования было обнаружено, что датчик демонстрирует более высокий отклик (селективность) для ЖК при рабочем потенциале +250 мВ по сравнению с Ag / AgCl и более низкий отклик для ацетальдегида, метилглиоксаля, бутиральдегида, метанола и этанола , Значительное увеличение селективности сенсора было достигнуто при более низких потенциалах рабочего электрода ().

Амперометрический отклик хемосенсора на основе 3,05 мм стержневого платинированного углеродного электрода для различных аналитов при различных рабочих потенциалах: +250 мВ, +50 мВ, 0 мВ в сравнении с Ag / AgCl (20 мМ аналит в 20 мМ фосфатном буфере (ПБ), рН 7,5).

Как показано на рисунке, уменьшение рабочего потенциала приводит к снижению неспецифического ответа на метанол при сохранении высокого ответа на ЖК. Снижение неспецифической реакции сенсора на спирты и некоторые альдегиды при низком потенциале (0 мВ по сравнению с Ag / AgCl) позволяет довольно избирательно определять ФА в реальных образцах.

Результаты теста на линейность для двух платинированных углеродных электродов - стержня 3,05 мм и плоского электрода 4 мм DRP-150 - представлены в. Диапазон линейности для двух типов электродов демонстрирует существенные различия. Например, верхний предел линейности для 4-мм плоского Pt-углеродного электрода DRP-150 (площадь рабочей поверхности = 12,6 мм2) составляет 5 мМ. Это значительно выше, чем предел линейности 2,5 мМ для Pt-углеродного электрода стержня 3,05 мм (площадь рабочей поверхности = 7,3 мм2). Однако чувствительность первого в три с половиной раза ниже, чем второго (0,51 и 1,85 мкА · мМ -1 · мм2 соответственно).

( a ) Испытание на линейность для амперометрического отклика 3,0-мм стержневого Pt-углеродного электрода и 4-мм плоского Pt-углеродного электрода DRP-150 к FA; ( б ) Условия: рабочий потенциал 0 мВ относительно Ag / AgCl, 20 мМ PB, pH 7,5. Наклоны линий (как характеристики чувствительности) и R (коэффициенты линейной регрессии) показаны на вставках.

Изучена стабильность при хранении хемосенсорных электродов. Каталитическая поверхность электрода не теряла своих свойств даже после более чем одного года хранения в сухом темном месте при комнатной температуре.

2.1.3. Определение ФА в образцах сточных вод

Дальнейшие эксперименты показали, что использование плоского платинированного золотого электрода привело к существенному улучшению чувствительности к ФА (3,76 мкА · мМ -1 · мм2 по сравнению с 0,51 мкА · мМ -1 · мм2 для плоского Pt-углеродного электрода DRP-150). Этот электрод был поэтому исследован далее.

Поскольку FA является химически очень активным соединением, которое может реагировать с различными компонентами анализируемых образцов, анализ проводился в режиме множественных стандартных добавок ().

Амперометрическое определение формальдегида в пробе сточных вод с использованием 4 мм плоского Pt-золотого электрода DRP-C220AT. Условия: рабочий потенциал 0 мВ против Ag / AgCl, 20 мМ PB, pH 7,5. Параметры линии («A» и «B») показаны на вставках: «A» - соответствует сигналу анализируемого образца без добавления стандарта FA, «B» - наклон калибровочной кривой и « R »- коэффициент линейной регрессии,« n »- разведение исследуемого образца. Калибровочную кривую получали путем добавления аликвот стандартного раствора FA к анализируемому образцу.

Анализ пробы сточных вод, содержащей 4,90 ± 0,15 мМ ФА (оценивается химическим методом с использованием хромотропной кислоты [ 29 ]) выявлено значение 4,71 ± 0,09 мМ, что соответствует точности определения 96%. T- тест студентов подтвердил несущественность различий между результатами, полученными двумя методами.

Хотя селективность описанного хемосенсора ниже по сравнению с биосенсорами на основе формальдегиддегидрогеназы, ранее сообщенными нами [ 25 , 27 , 30 , 31 ], он является более селективным по сравнению с амперометрическим биосенсором на основе алкогольоксидазы, который генерирует положительный выход не только для формальдегида, но и еще более высокий сигнал для метанола и этанола [ 32 ]. Потенциометрический биосенсор на основе AOX [ 33 ] обладает хорошей селективностью к ФА, но его чувствительность ниже, чем у описанного в настоящее время хемосенсора. По сравнению с сенсорами на основе формальдегиддегидрогеназы хемосенсор проще по конструкции, поскольку для него не требуется фермент и два коэнзима (НАД + и глутатион).

2.2. Полуколичественный визуальный биосенсор для бортовых ТВС

Была сконструирована система, которая меняет цвет при контакте с ТВС в газовой фазе, чтобы разработать простой недорогой полуколичественный биосенсор для определения АВ в воздухе. Система была основана на мембране, которая отделяла водную фазу, которая содержит хромоген и ферменты AOX и HRP, а также FA-содержащую газовую фазу. ЖК диффундирует через мембрану в водную фазу и участвует в следующем цепном процессе, который катализируется ферментами [ 34 ]:

Скорость появления цвета во второй реакции фактически зависела от концентрации ЖК в водной фазе, которая, в свою очередь, зависела от концентрации ЖК в газовой фазе. Для изучения этого эффекта было проведено несколько экспериментов с использованием закрытого сосуда, который содержал слой водного раствора ЖК с известной концентрацией. Закон Генри позволяет рассчитать концентрацию воздушно-капельного ФА [ 35 ], что также было подтверждено измерениями с помощью детектора газа FA. Мембранные устройства, содержащие различные концентрации AOX, HRP и хромогена, были помещены над водным слоем в контакте исключительно с газовой фазой. Реакции (1) и (2) происходили при диффузии ЖК через мембрану в водную фазу, и регистрировалось время четко видимого появления цвета. Затем мембранные устройства извлекали из сосуда, открывали и измеряли интенсивность цвета спектрофотометрически на соответствующей длине волны [ 36 ]. Было установлено, что интенсивность цвета во всех случаях соответствует диапазону поглощения А (450 нм) от 1 до 1,2. Наиболее четкие результаты были получены при использовании HRP в концентрации 3,5 мг · мл -1 (1000 ед. · Мл -1) и хромогена в концентрации 2 мг · мл -1. Согласно паспорту безопасности материала (MSDS), пороговое значение уровня (TLV) воздушно-капельной FA составляет 0,3 ppm [ 37 ]. Поэтому в качестве фиксированных точек для оценки времени реакции были выбраны три скорости ЖК, 0,1, 0,3 и 18,5 ч / млн. Первая точка соответствует безопасному уровню ФА, вторая - максимально допустимому уровню, а третья считается опасным для человека. Оптимальный биосенсор будет немедленно реагировать на опасный уровень ТВС, будет реагировать умеренно на допустимый уровень и вообще не будет реагировать на безопасный уровень. Для достижения этой цели было изучено влияние активности AOX на время развития цвета (). Было установлено, что время реакции обратно зависит от концентрации AOX, и после того, как цвет проявился, он оставался стабильным в течение по крайней мере получаса ().

Развитие окраски в мембранных устройствах, содержащих 3,5 мг · мл-1 HRP, 2 мг · мл-1 хромогена и 5 или 10 ед · мл-1 AOX. Устройства подвергались воздействию воздушно-капельной FA в концентрации 0,3 ppm, и интенсивность цвета измерялась в различные периоды времени, начиная с точки развития цвета.

На следующем этапе было изучено влияние концентрации ЖК в воздухе на время развития окраски. Для этой цели концентрация AOX в мембранных устройствах поддерживалась постоянной, и устройства подвергались воздействию различных концентраций воздушно-капельного FA ().

Время развития окраски в мембранных устройствах, содержащих HRP - 3,5 мг · мл -1, хромоген - 2 мг · мл -1 и AOX - 2,5 ед · мл -1. Устройства подвергались воздействию воздушно-капельной FA при различных концентрациях, и время реакции регистрировалось.

Как показано в, время развития цвета зависит от концентрации ЖК в газовой фазе, и чем выше концентрация ЖК, тем короче время реакции. Этот факт легко объясняется зависимостью скорости диффузии ЖК через мембрану из газообразной в водную фазу от концентрации ЖК в воздухе.

Были проведены эксперименты с различными концентрациями FA и AOX, чтобы определить и выбрать условия для селективной реакции мембранного устройства на безопасные и опасные концентрации FA в газовой фазе. Результаты этой серии представлены в. Как показано на рисунке, практически не было различий между временем проявления цвета при воздействии 0,1 и 18,5 ч / млн при высоких концентрациях AOX (от 5 до 10 ед. · Мл-1) - цвет появился уже через 12–20 мин в первом случае и через несколько минут во втором. При средней концентрации AOX (2,5 ед. · Мл-1) время реакции до высоких и низких уровней ЖК четко различалось - устройство меняло цвет в течение 3–5 минут при воздействии 18,5 ч / млн и в течение 40 минут при воздействии 0,3 ч / млн. , Однако реакция до 0,1 ч / млн имела место через 60 мин, так что разница между безопасным и пороговым уровнями была недостаточно четкой. Результаты для самой низкой применяемой концентрации AOX (1,25 Ед / мл-1) были очень удовлетворительными. Устройство очень быстро реагировало на опасную концентрацию FA 18,5 ppm и очень медленно (1 ч) на концентрацию TLV, но никак не реагировало на безопасную концентрацию 0,1 ppm (цвет не проявлялся в течение 24 ч воздействия) , Этот результат позволил однозначно дифференцировать безопасные, пороговые и опасные концентрации воздушно-капельных ТВС Это также позволило сделать вывод о том, что предлагаемое мембранное устройство может быть использовано в качестве полуколичественного биосенсора для обнаружения ТВС в воздухе помещений. Простота устройства открывает перспективы его широкого применения на рабочих станциях, связанных с использованием ТВС, от мастерских до лабораторий. Устройство показало хорошую воспроизводимость и достоверность результатов. В экспериментах, в которых поглощение света измерялось в выбранные периоды времени, относительные стандартные ошибки (δ) не превышали 3%. В экспериментах, в которых измеряли время развития визуального цвета, относительные стандартные ошибки варьировались от 20% для коротких периодов (несколько минут) до 2% для длительных периодов (более часа).

Время развития окраски в мембранных устройствах, содержащих 3,5 мг · мл-1 HRP, 2 мг · мл-1 хромогена и различные концентрации AOX. Устройства подвергались воздействию воздушно-капельной FA при различных концентрациях, и время реакции регистрировалось.

Предлагаемый биосенсор для полуколичественного определения воздушно-капельного ФА имеет ряд преимуществ по сравнению с существующими инструментальными методами обнаружения, такими как хроматография или селективные газоанализаторы [ 37 ]. Биосенсор не требует какой-либо инструментальной поддержки, но в то же время обеспечивает почти немедленную реакцию на опасные уровни ЖК, когда четко прослеживается развитый визуальный сигнал. Единственным недостатком этого биосенсора является его необратимость, поскольку после его развития цвет не исчезает. Однако эта проблема компенсируется низкой стоимостью и простотой устройства, которое можно производить оптом и хранить в течение длительного времени, поскольку AOX и HRP известны своей высокой стабильностью [ 38 , 39 ].

Похожие